植物光合作用為生物提供物質(zhì)、能量和氧氣，光合作用相關(guān)的生物過程必須與生物鐘緊密協(xié)調(diào)，才能最大限度地提高光合效率。鎂是光合作用的重要元素，2020年福建農(nóng)林大學(xué)陳志長課題組報道了一個水稻葉綠體鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白OsMGT3，負(fù)責(zé)向葉綠體節(jié)律性輸入鎂離子，進而調(diào)節(jié)光合碳固定（Li et al., Nature Plants, 2020），然而，OsMGT3是如何受到生物鐘調(diào)控來影響光合過程還不清楚。
2022年9月16日，陳志長課題組在國際學(xué)術(shù)期刊Molecular Plant在線發(fā)表了題為“Two central circadian oscillators OsPRR59 and OsPRR95 modulate magnesium homeostasis and carbon fixation by regulating rhythmic expression of OsMGT3 in rice”的研究論文，發(fā)現(xiàn)了兩個核心晝夜節(jié)律振蕩器OsPRR59和OsPRR95負(fù)向調(diào)控水稻OsMGT3的節(jié)律性表達(dá)。該研究認(rèn)為OsMGT3介導(dǎo)的碳固定通過糖信號正向調(diào)節(jié)ROS水平，而ROS又通過誘導(dǎo)OsPRR95和OsPRR59的表達(dá)來抑制OsMGT3。這種反饋回路為增強植物生物鐘和光合作用之間的相互作用提供了一種新的途徑。
該研究首先通過酵母單雜交篩選試驗，發(fā)現(xiàn)PRR家族蛋白能與OsMGT3上游啟動子結(jié)合。考慮到PRR家族在植物生物鐘調(diào)節(jié)中的重要作用，研究者將水稻中所有的PRR進行酵母單雜交和EMSA驗證。隨后，研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生各種PRR突變體，發(fā)現(xiàn)只有在osprr95 59雙突變體中才能觀察到OsMGT3表達(dá)水平的顯著變化，暗示OsPRR95和59之間可能存在功能冗余。此外，osprr95 59雙突變體中OsMGT3表達(dá)水平升高，而OsPRR95和OsPRR59過表達(dá)系中OsMGT3表達(dá)水平下降，進一步證實了OsPRR95/59對OsMGT3轉(zhuǎn)錄的抑制作用。
OsPRR1, 95和59結(jié)合OsMGT3啟動子抑制其轉(zhuǎn)錄
由于OsMGT3介導(dǎo)了水稻葉綠體中的鎂轉(zhuǎn)運和隨后的碳固定，因此本研究進一步對OsPRRs是否也參與葉綠體鎂穩(wěn)態(tài)和光合作用進行了分析。與野生型相比，osprr95 59雙突變體的碳同化速率（An）顯著提高，與OsMGT3過表達(dá)株系的An水平相當(dāng)。過表達(dá)OsPRR95或59會降低An在日周期內(nèi)的水平，與osmgt3突變體的水平相似。另外，葉綠體中鎂的含量也是與An呈現(xiàn)出一致的水平。研究者利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的熒光蛋白MARIO來檢測葉綠體中游離鎂離子的含量，發(fā)現(xiàn)OsMGT3和OsPRR95/59的表達(dá)變化在黎明時對基質(zhì)中游離鎂離子的影響很大。這表明OsPRR95和59通過調(diào)控鎂轉(zhuǎn)運蛋白基因OsMGT3參與葉綠體中游離鎂離子的動態(tài)變化，進而調(diào)控光合碳固定。
隨后，研究者通過外源添加不同糖源和各種影響ROS水平的化學(xué)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)OsPRRs-OsMGT3調(diào)控模塊與細(xì)胞體內(nèi)的糖和ROS水平密切相關(guān)。OsPRR95、OsPRR59以及OsMGT3的晝夜節(jié)律性表達(dá)都受到了蔗糖和超氧陰離子的顯著影響。同時，osprr95 59雙突變體和OsMGT3過表達(dá)系在白天內(nèi)源性蔗糖和超氧陰離子水平均升高，而osmgt3突變體和OsPRR95/59過表達(dá)系在白天內(nèi)源性蔗糖和超氧陰離子水平均降低。以上結(jié)果表明糖信號和ROS信號參與了OsPRRs-OsMGT3調(diào)控模塊，并形成負(fù)反饋回路。
鑒于OsPRRs-OsMGT3-sugar-ROS反饋回路需要鎂轉(zhuǎn)運的參與，因此研究者進一步調(diào)查了該回路與缺鎂脅迫的關(guān)系。結(jié)果顯示，缺鎂脅迫顯著降低了光合碳固定，但是增強了ROS以及蔗糖在水稻體內(nèi)的大量積累。缺鎂脅迫處理后OsMGT3的表達(dá)被顯著抑制，而OsPRR95和59的表達(dá)則顯著升高。有趣的是，添加DPI來抑制超氧陰離子后，導(dǎo)致缺鎂誘導(dǎo)的光合抑制和基因表達(dá)量的改變被減弱，但對蔗糖積累影響不大。以上結(jié)果表明，水稻通過整合缺鎂信號與這個反饋回路來對缺鎂脅迫做出生理響應(yīng)，也說明OsPRRs-OsMGT3調(diào)控途徑可以提高水稻在不利環(huán)境中的生存適應(yīng)性。
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